Lange Sequenzfragmente, neue Erkenntnisse: Was die Long-Read Sequenzierung in der Diagnostik leistet

Ein neues Verfahren mit wachsendem Einsatzspektrum

Am genetikum setzen wir seit Kurzem auf die Long-Read Sequenzierung (LRS) und bauen den Einsatz dieser Technologie derzeit gezielt auf immer mehr diagnostische Fragestellungen aus. Zur Einordnung: Unsere etablierte Sequenzierung mit Illumina-Geräten ist ein Short-Read-Verfahren, die DNA wird dabei in sehr viele kurze Abschnitte von nur 150 bis 300 Basenpaaren zerlegt, sequenziert und anschließend am Computer wieder zusammengesetzt. Die Long-Read Sequenzierung mit der Technologie von Oxford Nanopore Technologies (ONT) geht einen anderen Weg: Ein einzelner DNA-Strang wird am Stück durch eine winzige Pore geschleust und dabei direkt ausgelesen, im Schnitt entstehen bei uns Reads (Sequenzfragmente) von 10.000 Basenpaaren Länge, teils auch deutlich mehr. Das dafür verwendete Sequenziergerät liefert die Daten bereits während des laufenden Sequenzierprozesses in Echtzeit.

Adaptive Sampling: gezielt lesen, was zählt

Statt das gesamte Genom zu sequenzieren, nutzen wir Adaptive Sampling: Für jeden DNA-Strang wird bereits zu Beginn geprüft, ob er zu unseren Zielregionen gehört. Passt er, wird er vollständig ausgelesen, passt er nicht, wird er sofort wieder verworfen, um Kapazität für den nächsten Strang freizugeben. So entsteht eine gezielte Anreicherung ganz ohne PCR  und neue Gene lassen sich mit vergleichsweise geringem Aufwand rein digital ergänzen. Genau das ist auch der Grund, warum wir das Verfahren aktuell so stetig auf weitere Bereiche ausweiten können.

Repeat-Expansionen: Länge ist nicht alles

Bei Repeat-Expansionen, krankheitsverursachenden Wiederholungssequenzen wie bei bestimmten Ataxien, zeigt sich ein ähnliches Bild. Die klassische, PCR-basierte Fragmentanalyse kann nur die Länge einer Wiederholung bestimmen, nicht aber ihre innere Struktur. Die Long-Read Sequenzierung deckt die komplette Wiederholungsregion mit einem Read ab und macht dabei auch Unterbrechungen innerhalb der Wiederholungssequenz sichtbar. Liegt bei einer Person beispielsweise im ATXN1-Gen (SCA1) eine Unterbrechung innerhalb der Wiederholungssequenz vor, kann dies gegen eine krankheitsverursachende Rolle der Variante sprechen. Insbesondere im intermediären Längenbereich, für den bislang nur begrenzte wissenschaftliche Daten vorliegen, kann diese Detailinformation entscheidend für die Bewertung sein. Erste Studien haben zudem gezeigt, dass auch im FGF14-Gen (SCA27B) Unterbrechungen innerhalb der Wiederholungssequenz auftreten können.

Der eigentliche Mehrwert: komplexe Umbauten sichtbar machen

Der vielleicht größte Vorteil von der Long-Read Sequenzierung zeigt sich abseits einzelner Punktmutationen, bei komplexen strukturellen Veränderungen, die sich über größere, oft nicht-kodierende Bereiche erstrecken. Kurze Reads können solche Umbauten nur schwer vollständig erfassen, weil sie die beteiligten Bruchpunkte nicht gemeinsam überspannen. Ein frühes Beispiel aus unserer eigenen Praxis: Einer der ersten mit der Long-Read Sequenzierung bearbeiteten Fälle sollte eigentlich nur eine bereits bekannte Deletion bestätigen. Tatsächlich zeigte sich aber ein deutlich komplexeres Bild, die Sequenz brach an einer Stelle ab, ein Abschnitt fehlte, ein weiteres Stück lag invertiert vor, dann setzte sich die ursprüngliche Sequenz fort, mit einem erneuten Sprung kurz danach. Dieser komplexe Umbau lag in intronischen Bereichen, die mit der Whole-Exome Sequenzierung mit Short-Read Sequenzierung schlicht unsichtbar geblieben wären.

Die Long-Read Sequenzierung ist bei uns damit kein Pilotprojekt mehr, sondern fester Bestandteil der Diagnostik und wir bauen das Einsatzspektrum kontinuierlich weiter aus. Gerade die Flexibilität von Adaptive Sampling macht es vergleichsweise einfach, neue Zielregionen zu ergänzen.