Labor

Mit der Gen-Panel und Whole Exome Diagnostik werden eine Vielzahl von Genen parallel in einem Ansatz mit Next Generation Sequencing (NGS) in einem Arbeitsschritt untersucht. Für Krankheitsbilder, die durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Genen verursacht sein können, ist damit eine schnelle und auch kostensparende Diagnostik möglich.

In einem erkrankungsspezifischen Gen-Panel werden dabei mehrere Gene, die mit einem bestimmten Krankheitsbild assoziiert sind, gleichzeitig sequenziert. Die Anwendung von Gen-Panels ist besonders bei heterogenen Erkrankungsgruppen wie Muskelerkrankungen, neurologischen Erkrankungsbildern, unklaren Fehlbildungs- und Retardierungssyndromen sowie auch bei Epilepsien zielführend. Die Anzahl der sequenzierten Gene ist abhängig von der Erkrankungsgruppe und variiert stark von wenigen einzelnen Genen bis hin zu über tausend sequenzierten Genen.

Bei vielen syndromalen Erkrankungen, insbesondere im Kindesalter, können Symptome von verschiedenen Erkrankungsgruppen gleichzeitig auftreten. Eine Eingrenzung der in Frage kommenden Gene, die defekt sein können, ist dann nicht ohne weiteres möglich und die Diagnostik mit einem erkrankungsspezifischen Gen-Panel nicht zielführend. Zur genetischen Abklärung ist dann die Sequenzierung des gesamten Exoms (Whole Exome, WES) indiziert, die häufig auch als Trio-Diagnostik durchgeführt wird. Die Whole Exome Diagnostik umfasst die Anreicherung und Sequenzierung praktisch aller relevanten proteincodierenden Bereiche (ca. 20 000 Gene).

Bei der Trio-Diagnostik werden neben dem Patienten auch die Eltern in die Analyse einbezogen. Die Familienuntersuchung erlaubt es nach möglichen Varianten zu filtern und zielgerichtet auszuwerten. Dies führt zu höheren Aufklärungsraten, da eine bessere Identifizierung und Interpretation von bisher klinisch mit der Erkrankung nicht assoziierten Genen und Varianten dadurch möglich ist. Darüber hinaus wird durch dieses Vorgehen die Entdeckung von neu entstandenen und ursächlichen Mutationen deutlich verbessert. Durch die Erstellung von Genlisten anhand von klinischen Symptomen (HPO, human phenotype ontology) kann die Anzahl der in Frage kommenden Gene bei der Auswertung symptombasiert eingegrenzt werden.

Diese Analysen kommen insbesondere auch für pränatale Untersuchungen in Betracht, wenn in der Ultraschalluntersuchung schwere Fehlbildungen wie z.B. Herzfehler, Skelettdysplasien oder Hirnfehlbildungen festgestellt werden oder der Hinweis auf ein komplexes Syndrom besteht.

Vor der Durchführung einer Exom-Diagnostik muss immer eine Genetische Beratung nach GenDG erfolgen.

Ziel der Einzel-Gen-Diagnostik bzw. molekulargenetischen Diagnostik ist das Nachweisen beziehungsweise Ausschließen von krankheitsverursachenden Fehlern (Mutationen) oder krankheitsdisponierenden Variationen (Polymorphismen) in einzelnen Genen. Dazu werden Veränderungen oder Verluste einzelner Gene erfasst, die lichtmikroskopisch nicht nachweisbar sind.
Entsprechend der Fragestellung werden mit dem jeweils geeigneten Verfahren die gesuchten Mutationen oder Polymorphismen dargestellt.
Bei der Sequenzierung zum Beispiel wird die genaue Basenabfolge auf der DNA in einem bestimmten Genabschnitt dargestellt. Mit Hilfe von fluoreszenzgefärbten Basenbausteinen (je eine Farbe für die vier Bausteine A, C, T, G) wird DNA vervielfältigt (PCR) und durch eine Software die Basenabfolge bestimmt.

Mit der array-CGH (= comparative genome hybridization) können sehr kleine, unbalancierte Chromosomenaberrationen entdeckt werden, die mit der konventionellen Chromosomenanalyse nicht feststellbar sind. Dabei werden nicht die DNA-Sequenzen einzelner Gene untersucht, sondern "Dosisunterschiede“ im Sinne von Deletionen und Duplikationen bezogen auf das Gesamtgenom festgestellt. Damit ist es möglich, auf Gen-Ebene einen Verlust oder Zugewinn von Chromosomenmaterial nachzuweisen (molekulare Karyotypisierung).

Um sie durchführen zu können, werden teilungsfähige Zellen benötigt, die sorgfältig gepflegt und vermehrt werden, bis ausreichend teilungsfähige Zellen zur Verfügung stehen. Nach Präparation und Färbung der Zellen werden die Chromosomen lichtmikroskopisch numerisch und strukturell analysiert. Durch den Vergleich der für jedes Chromosom spezifischen Abfolge von Banden können beispielsweise Inversionen, Translokationen, Duplikationen oder Deletionen einzelner Chromosomen nachgewiesen werden.

Die FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) ist eine Technik, die es ermöglicht, spezifische Nukleinsäuresequenzen in einem Zellpräparat sichtbar zu machen. Dabei werden mit Fluorochromen markierte DNA-Sonden direkt auf Chromosomenpräparate hybridisiert und durch Fluoreszenzsignale in der Metaphase oder Interphase sichtbar gemacht. Diese können dann als farbige Punkte im Fluoreszenz-Mikroskop erkannt werden. Damit kann beispielsweise an einem Zellkern nachgewiesen werden, ob der gesuchte Chromosomenabschnitt in normaler Anzahl (zweifach, Disomie) vorliegt. In Folge einer Deletion kann dieser fehlen oder beispielsweise bei einer Trisomie in dreifacher Form vorhanden sein. Die angewandten DNA-Sonden decken unterschiedlich große Bereiche der Chromosomen ab und kommen bei unterschiedlichen Fragestellungen zum Einsatz.

Mit Hilfe des Carrier Screening können sich Paare mit Kinderwunsch auf Anlageträgerschaft von schweren genetisch-bedingten Erkrankungen untersuchen lassen. Auch wenn beide Elternteile gesund sind, können sie Anlagen in sich tragen, die bei ihren Kindern zu einer schweren Krankheit führen. Es ist nicht selten, dass man Anlageträger einer genetischen Erkrankung ist. In der Normalbevölkerung ist jede Person Träger von durchschnittlich 2,8 rezessiven Mutationen, die krankheitsursächlich für bekannte schwere Erkrankungen im Kindesalter sind. Blutsverwandte Paare haben ein deutlich erhöhtes Risiko Anlageträger derselben Erkrankung zu sein.
Das Carrier Screening kann Paaren helfen eine informierte Entscheidung und Wahl in Bezug auf ihre Familienplanung zu treffen!

Sie haben dann die Möglichkeit:

• bei schweren Erkrankungen eine Pränataldiagnostik oder ggf. eine Präimplantationsdiagnostik durchführen zu lassen
• für die Schwangerschaft und die Geburt entsprechenden Vorbereitungen zu treffen und Spezialisten aufzusuchen
• rechtzeitig therapeutische Maßnahmen zu ergreifen, die für einzelne Erkrankungen bereits zur Verfügung stehen

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Zusätzlich zur Chromosomenanalyse kann aus dem Fruchtwasser auch die Acetylcholinesterase bestimmt werden. Ein positiver ACHE-Nachweis kann auf Neuralsrohrdefekte, Gastroschisis, Ompahlozele, Zystenhygrom, fetale Aszites, Aneuploidie, intrauterinen Fruchttod, Teratom oder Nierenzysten hinweisen.
Der ACHE-Wert kann auch bei mit mütterlichem Blut kontaminierten Fruchtwasser-Proben positiv sein. In Kombination mit der AFP-Bestimmung bietet die ACHE-Untersuchung eine größere Sicherheit als die alleinige Bestimmung des AFP-Wertes. In etwa 5 % der Fälle findet sich trotz erhöhtem ACHE-Wert im Fruchtwasser keine ernsthafte fetale Missbildung. Die Bestimmung des AFP Wertes aus Fruchtwasser erfolgt über einen ELISA Test. Das AFP kann bei Spaltbildungen wie Lippen-Kiefer-Gaumenspalte oder einem offenen Rücken (Spina bifida), aber auch bei Anencephalus, Encephalocele, Omphalocele, sowie Atresien des Magen-Darm-Traktes erhöht sein.

Gedeckte Neuralrohrdefekte (Spina bifida aperta) mit intakter Haut werden nicht erkannt. Die Auswertung erfolgt durch Vergleich des Messwertes der Patientin im Verhältnis zum Meridian aller Messwerte des Labors von Patientinnen in derselben Schwangerschaftswoche (MoM-Wert, multiple of Meridian). Der MoM-Wert kann durch eine falsche Angabe der Schwangerschaftswoche beeinflusst werden.